當牙周炎、類風濕關節炎等炎癥性疾病發生時，巨噬細胞被募集并極化為M1促炎表型。這些長期活動的M1巨噬細胞隨后產生高水平的NO、活性氧和促炎細胞因子，導致持續的炎癥反應。促炎細胞因子可促進成骨細胞產生RANKL的受體激活劑，導致破骨細胞過度形成，從而破壞骨穩態。

間充質干細胞（MSCs）因具有強大的免疫調節能力而被廣泛用于各種炎癥性疾病的治療，包括牙周炎。越來越多的證據表明，MSCs的治療效果主要歸因于其分泌的旁分泌因子，其中最關鍵的是細胞外囊泡（EV），包括外泌體（EXO）、小細胞外囊泡（sEV）。有研究表明，MSC-sEV在免疫調節和誘導組織修復再生等治療效果上與MSC類似，且在安全性、存儲和給藥方面比MSC療法更具優勢，因此被認為是一種大有潛力的治療方法。

牙髓干細胞（DPSCs）是從成人牙髓中分離出來的一種間充質干細胞，其容易獲得，且不會引起任何倫理問題。據報道，牙髓干細胞來源小細胞外囊泡（DPSC-sEV)顯示出比骨髓間充質干細胞來源小細胞外囊泡（BMSC-sEV）更強的免疫調節作用。不過，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的生成，目前還是一個未知數。此外，體外培養的MSCs通常暴露在常氧（21% O2）條件下，而體內相當一部分MSCs存在于低氧環境中（2%-8%），那么在低氧條件下產生的DPSC-sEV是否能發揮更好的治療效果？

為此，中山大學附屬口腔醫院的研究團隊發現，低氧誘導的DPSC-sEV通過調節巨噬細胞極化和破骨細胞生成來改善炎癥性骨溶解。這項成果于近日發表在《Bioactive Materials》雜志上，有望為骨髓炎、牙周炎、類風濕關節炎等常見病的治療帶來一種新策略。

文獻封面截圖[1]

研究材料與方法

研究人員從SD大鼠上頜中切牙的牙髓中分離出DPSCs，并鑒定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell?MSC成脂誘導分化試劑盒、OriCell?茜素紅染色液、OriCell?油紅O染色液等產品為該項研究助力）。

之后，研究人員從DPSCs中分離出小細胞外囊泡（sEV），并開展了一系列的分析。在體內研究中，使用了LPS誘導的小鼠顱骨炎性骨吸收模型，體外研究則使用了RAW264.7巨噬細胞。

技術路線

從DPSCs中分離出sEV，發現低氧誘導了DPSCs的sEV釋放

Hypo-sEV誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成，從而改善了LPS誘導的炎癥性骨吸收

通過miRNA表達譜分析等實驗，發現Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導的

miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達，來調節巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成

研究結果

01

Hypo-sEV促進巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成

在分離出DPSCs后，研究人員經過流式分析和免疫熒光分析，確認培養的DPSCs具有MSC的間質表型，并具備多潛能分化能力。隨后，他們通過超速離心法從常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)條件下培養的DPSCs上清液中分離出sEV，分別命名為Nor-sEV和Hypo-sEV。結果發現，這兩種sEV都表現出典型的EV特征，但Hypo-sEV的濃度更高，且蛋白質濃度也明顯更高。而且，通過sEV蛋白標志物分析，發現低氧明顯增加誘導了DPSCs釋放sEV。

為了比較這兩種sEV對炎癥性骨溶解的治療效果，研究人員使用了LPS誘導的小鼠炎癥性骨吸收模型。通過micro-CT掃描和組織學檢查評估，他們發現Nor-sEV對LPS誘導的骨溶解未能表現出明顯的治療效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠顱骨基質的炎癥性骨溶解，即提高了BV/TV值，并減少了骨侵蝕面積（圖1）。這些結果表明，Hypo-sEV明顯改善了LPS誘導的體內炎癥性骨吸收。

圖1. Hypo-sEV在體內抑制LPS誘導的炎癥性骨吸收[1]

由于巨噬細胞從M1到M2的表型轉變可促進骨修復，故研究人員接著分析了Hypo-sEV是否可促進體內的巨噬細胞M2極化。LPS導致CD68+iNOS+巨噬細胞（M1表型）數量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得顱骨基質中出現了更多的CD68+Arg1+巨噬細胞（M2表型），且Hypo-sEV處理后的M1巨噬細胞更少，M2巨噬細胞更多。與Nor-sEV相比，Hypo-sEV明顯抑制IL-1β的表達，促進IL-10和Arg1的表達。由此可見，Hypo-sEV可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，并誘導巨噬細胞M2極化。

炎癥性骨吸收是由破骨細胞的過度生成引起的，因此研究人員還研究了Hypo-sEV是否能抑制體內破骨細胞的生成。他們發現，Nor-sEV和Hypo-sEV都減少了LPS誘導的破骨細胞（TRAP陽性）數量，且Hypo-sEV組的破骨細胞數量低于Nor-sEV組。體外培養實驗也表明，這兩種sEV抑制了RANKL誘導的破骨細胞分化，且Hypo-sEV組的抑制效果優于Nor-sEV組。這些數據顯示，Hypo-sEV在體內和體外直接抑制了破骨細胞生成。

02Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而發揮作用

為了進一步分析這背后的分子機制，研究人員決定從miRNA研究入手。他們利用新一代測序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表達譜。結果發現，與Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45個miRNA上調，64個miRNA下調。在重點關注與巨噬細胞炎癥反應或破骨細胞分化有關的miRNA后，他們還發現Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相對于Nor-sEV升高。后續分析顯示，miR-210-3p在介導Hypo-sEV的治療效果方面發揮了關鍵作用。

接著，通過對RAW264.7細胞與兩種sEV的共培養分析，進一步發現了Hypo-sEV可以將miR-210-3p遞送到巨噬細胞和破骨細胞中。miR-210-3p抑制劑提高了促炎細胞因子和iNOS的表達，同時降低了IL-10和Arg1的表達，減弱了Hypo-sEV誘導巨噬細胞M2極化的能力。此外，miR-210-3p抑制劑也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨細胞形成的能力以及破骨細胞生成相關基因的表達（圖2）。這些結果表明，Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成。

圖2. Hypo-sEV在體外通過遞送miR-210-3p而誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成[1]

之后，實驗轉移到小鼠模型上繼續進行。為了進一步確認Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導的，研究人員在LPS誘導的炎癥性骨吸收模型中使用了miRNA抑制劑antagomir-210-3p。結果顯示，antagomir-210-3p明顯消除了Hypo-sEV的治療作用。而且與對照相比，antagomir-210-3p的加入導致M1型巨噬細胞增加，M2型巨噬細胞減少。這些結果證實。miR-210-3p通過誘導巨噬細胞M2極化和抑制破骨細胞生成而明顯改善了LPS誘導的炎癥性骨溶解。

后續的分析發現，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活對巨噬細胞M1極化和破骨細胞生成至關重要。miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達來調節巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成。

結論

圖3. miR-210-3p抑制LPS誘導的炎癥性骨吸收的示意圖[1]

這項研究表明，低氧預處理不僅誘導了DPSC-sEV的分泌，還增強了DPSC-sEV介導的對LPS誘導的骨溶解的治療效果。其中，miR-210-3p通過誘導巨噬細胞M2極化和抑制破骨細胞生成來保護骨骼。

因此，低氧誘導的DPSC-sEV和miR-210-3p的這種“一石二鳥”作用有助于開發新策略來治療炎癥性或感染性骨溶解。

文章轉載自：OriCell細胞生物學微信公眾號